Wie kann man geeignete Passagier-DNA gewinnen (in unserem Fall also menschliche Insulin-DNA)? Im Prinzip gibt es drei wichtige Methoden zur Gewinnung solcher DNA.
1.1 Shotgun cloning
Eine "Holzhammermethode", die bereits in den 70er Jahren des letzten Jahrhunderts von Craig VENTER entwickelt wurde. Mit Hilfe von Restriktionsendonucleasen oder durch Einsatz physikalischer Methoden wird das komplette Genom des Spenderorganismus in handliche Bruchstücke zerlegt. Man erhält dabei eine Vielzahl von unterschiedlichen DNA-Sequenzen. Interessant sind aber nur die DNA-Bereiche, die etwa Genlänge besitzen, also ca. 5000 bis 20000 Basenpaare lang sind.
Die durchschnittliche Länge eines solchen Bruchstücks kann man durch die Wahl der Restriktionsendonuclease bestimmen, die eingesetzt wird. Schneidet das gewählte Enzym an häufig vorkommenden Stellen (z.B. ACCTG), so ist die Zahl der Fragmente hoch, und jedes Fragment ist entsprechend kurz. Nimmt man dagegen eine Restriktionsendonuclease, welche an seltener vorkommenden Stellen schneidet, so ist die Zahl der Bruchstücke relativ klein, und die Fragmente sind recht lang.
Ein Problem hat man aber immer, ganz egal, wie lang die Bruchstücke auch sind: Auf welchem Fragment befindet sich eigentlich das Gen, welches in das Plasmid eingebaut werden soll?
Angenommen, die DNA einer Menschenzelle wird in 5000 Fragmente zerlegt. Dann weiß man nicht, welches dieser Fragmente das Insulingen enthält. Also müsste man 5000 Klonierungsexperimente machen, jedes DNA-Fragment in eine Plasmid einbauen und in Bakterienzellen einsetzen und dann testen, ob eine dieser Bakterienzellen Insulin produziert. Insgesamt also ein sehr aufwändiges Verfahren.
1.2 Reverse Transkription
Hat man bereits mRNA des gewünschten Gens vorliegen, kann man durch reverse Transkription eine komplementäre cDNA herstellen und dann in eine doppelsträngige DNA umwandeln (Bild 2). Für das Insulin-Beispiel würde sich diese Methode empfehlen, denn in den Zellen der Bauchspeicheldrüse kommt recht viel Insulin-mRNA vor, die leicht gewonnen werden kann.
2 Herstellung von DNA aus mRNA
1.3 Künstliche DNA
Wenn man die genaue Basensequenz des zu klonierenden Gens kennt, kann man mit Hilfe moderner Automaten eine künstliche DNA synthetisieren lassen. Bei diesem Verfahren ist die Nachbehandlung der DNA besonders einfach.
Bei der gentechnischen Herstellung von Insulin setzt man heute überwiegend dieses dritte Verfahren ein. Die Aminosäure-Sequenz des Insulins ist seit Jahrzehnten aufgeklärt, und die Automaten der Gentechniker sind seit Jahren perfektioniert; die Herstellung eines so kurzen Gens wie des Insulin-Gens ist überhaupt kein Problem mehr. Außerdem kann man durch die künstliche Herstellung der Insulin-DNA einige Probleme vermeiden, die die anderen Methoden mit sich bringen.
1.4 Nachbehandlung
Unabhängig davon, wie die DNA gewonnen wurde, muss sie vor dem Einbau in den Vektor an den Enden noch so verändert werden, dass die eingesetzte Restriktionsendonuclease sticky ends (klebrige Enden) links und rechts vom eigentlichen Gen produziert. Das kann z.B. durch Anhängen kurzer, synthetischer DNA-Abschnitte (Linker) an die Enden erreicht werden.
