4.1.3 Einbau der Passagier-DNA in den Vektor

Schritt 1: Aufschneiden des Plasmids

Hier sehen wir einen kleinen Ausschnitt aus dem DNA-Doppelstrang eines bakteriellen Plasmids. In dieses Plasmid soll die Passagier-DNA eingebaut werden. Dazu muss das Plasmid zunächst einmal aufgeschnitten werden. Um DNA-Doppelstränge aufzuschneiden, setzt man bestimmte bakterielle Enzyme ein, die Restriktionsendonucleasen.

Die Restriktionsendonuclease in unserem Beispiel schneidet einen DNA-Doppelstrang überall dort, wo die Basensequenz TAGC vorkommt (bzw. die Komplementärsequenz ATCG).

Neben Restriktionsendonucleasen, die den Doppelstrang "glatt" durchschneiden, gibt es auch Restriktionsendonucleasen, die sogenannte "sticky ends" (klebrige Enden) erzeugen. Die Restriktionsendonuclease in unserem Beispiel gehört dazu. Die DNA wird nicht "glatt" auseinander geschnitten, sondern der eine Einzelstrang "lappt" etwas über.

Schritt 2: Vorbereitung der Passagier-DNA
Schritt 3: Einbau der Passagier-DNA

Damit die Passagier-DNA (1) in die Schnittstelle des Plasmids eingesetzt werden kann, müssen rechts und links von der einzubauenden DNA komplementäre "sticky ends" erzeugt werden. Nun ist es aber extrem unwahrscheinlich, dass zum Beispiel das menschliche Insulingen rein zufällig links und rechts Basensequenzen hat, die von der eingesetzten Restriktionsendonuclease durchgeschnitten werden. Man kann aber etwas nachhelfen. Da man genau weiß, welche Basensequenzen die Restriktionsendonuclease schneidet, kann man kurze künstliche DNA-Doppelstränge synthetisieren, die genau diese Schnittstelle enthalten. Solche Linker werden einfach links und rechts an die Passagier-DNA angeheftet (2). Wenn man jetzt die gleiche Restriktionsendonuclease anwendet, die man auch zum Zerschneiden des Plasmids eingesetzt hat, entstehen sticky ends, die komplementär zu den sticky ends des Plasmids sind (3). Die so behandelte Passagier-DNA kann nun leicht in das Plasmid eingesetzt werden (4).