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Enzymkinetik

Katalysatoren - Enzyme - Spezifitäten - Kinetik - Beeinflussung - Regulation

Eine Enzymreaktion wird untersucht

In einem Versuch werden acht Reagenzgläser mit Glucose-Lösungen unterschiedlicher Konzentration befüllt. Dann geben wir in jedes Reagenzglas je 10 Tropfen einer Lösung, die ein Enzym enthält, das Kohlendioxid aus Glucose freisetzt (Einzelheiten sparen wir uns hier, weil ich mir das Beispiel nur ausgedacht habe). Die folgende Tabelle zeigt nun die (hypothetischen) Versuchsergebnisse:

c(Glucose) in mol/l V(CO2) in μl / s
0,01 1
0,02 4
0,05 12
0,1 21
0,2 34
0,5 59
1,0 75
2,0 78

Hier die graphische Darstellung der Werte (ein μl ist übrigens 1/1000 ml):

Graphische Darstellung als typische Sättigungskurve

Graphische Darstellung der Versuchsergebnisse
Autor: Ulrich Helmich 2016, Lizenz: siehe Seitenende.

Diese Kurve sieht ganz nett aus, entspricht aber eigentlich gar nicht den Erwartungen, die man hat. Aus dem Chemieunterricht der Oberstufe wissen wir, das die Geschwindigkeit vR einer chemischen Reaktion von der Konzentration c(A) der Ausgangsstoffe abhängt.

Für monomolekulare Reaktionen, bei denen ein Ausgangsstoff A zu einem Produkt P reagiert, gilt die Gleichung

vR = k * c(A)

wobei k die Geschwindigkeitskonstante und c(A) die Konzentration des Ausgangsstoffs ist.

Bei bimolekularen Reaktionen, bei denen A-Teilchen und B-Teilchen zusammenstoßen müssen, damit P-Teilchen entstehen, gilt die Gleichung

vR = k * c(A) * c(B)

Auch bei der Zersetzung der Glucose sollte die Reaktionsgeschwindigkeit von der Glucosekonzentration abhängen:

vR = k * c(Glucose)

Die graphische Darstellung, in der die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von c(Glucose) gezeigt wird, sollte also die Form einer Geraden haben, die durch den Nullpunkt des Koordinatensystems geht. Statt dessen sehen wir eine typische Sättigungskurve.

Erklärung

Ein Enzymmolekül kann pro Sekunde nur eine bestimmte maximale Zahl von Substratmolekülen umsetzen: die Enzymkapazität ist begrenzt. Stellen wir uns einmal vor, die Kapazität unseres Enzyms läge bei einer Wechselzahl von 9.000 Glucose-Molekülen pro Sekunde. Unter der Wechselzahl versteht man die Zahl der Substrat-Moleküle, die ein Enzym-Molekül in einer bestimmten Zeit höchstens verarbeiten kann.

Angenommen, im ersten Reagenzglas (0,01 mol/l) trifft jedes Enzym-Molekül pro Sekunde im Schnitt auf 100 Glucose-Moleküle. Dies ist weit unter der Kapazität des Enzyms, es werden also alle 100 Substrat-Moleküle problemlos weiterverarbeitet.

Im zweiten Reagenzglas (0,02 mol/l) trifft jedes Enzym-Molekül auf ca. 200 Glucose-Moleküle. Auch dies ist weit unter der Enzymkapazität, daher können auch hier alle Glucose-Moleküle gespalten werden.

Auch bei den nächsten Reagenzgläsern ist dies der Fall: Die Enzyme treffen auf weniger Glucose-Moleküle pro Sekunde, als sie theoretisch verarbeiten könnten. Die Kapazität des Enzyms ist hier noch nicht ausgeschöpft.

Mit steigender Glucosekonzentration wird es aber langsam kritisch. In den letzten Reagenzgläsern ist die Glucosekonzentration schon so hoch, dass ein Enzym-Molekül nicht mehr jedes Glucose-Molekül verarbeiten kann, auf das es trifft. Irgendwann ist die Glucosekonzentration so hoch, dass alle Enzym-Moleküle unter Volllast arbeiten. Die Kapazitätsgrenze ist erreicht.

Wenn wir die Glucosekonzentration jetzt noch mehr erhöhen, verändert sich gar nichts mehr. Mehr als mit maximaler Kapazität können die Enzyme nicht arbeiten: 9.000 Glucosemoleküle pro Enzym und pro Sekunde.

Veranschaulichung der Enzym-Kinetik
Autor: Ulrich Helmich 2016, Lizenz: siehe Seitenende.

In dieser Abbildung ist das Ganze noch einmal anschaulich dargestellt. Im linken Kasten (niedrige Substratkonzentration) sind die Enzyme nicht ausgelastet. Manche Enzym-Moleküle sind sogar noch nicht von Substrat-Molekülen besetzt, sie "haben nichts zu tun". Im zweiten Kasten ist die Substrat-Konzentration zwar höher, aber die Enzyme arbeiten immer noch nicht mit Volllast. Selbst im dritten Kasten ist - zur Zeit der "Aufnahme" - noch ein Enzym-Molekül nicht besetzt. Im vierten Kasten schließlich ist die Substratkonzentration so hoch, dass die Enzyme voll ausgelastet sind, sie kommen mit ihrer Arbeit nicht mehr nach, nicht mehr alle Substrat-Moleküle können sofort umgesetzt werden. Eine weitere Erhöhung der Substratkonzentration würde jetzt keine Steigerung der Umsetzungsrate mehr nach sich ziehen.

Enzymaktivität

Die Enzymaktivität hängt von der Konzentration der Substrate ab: Je höher c(S), desto größer die Enzymaktivität, also die Geschwindigkeit, mit der das Enzym die Substrat-Moleküle umsetzt.

Allerdings ist diese Abhängigkeit nicht linear, sondern liegt in Form einer Sättigungskurve vor.

Ursache hierfür ist die begrenzte Kapazität eines Enzyms. Ein Enzym-Molekül kann pro Zeiteinheit nur eine bestimmte Anzahl von Substrat-Molekülen verarbeiten (Wechselzahl). Ist die Substratkonzentration zu hoch, sind die Enzyme voll ausgelastet. Eine weitere Steigerung der Substratkonzentration hat keine Steigerung der Enzymaktivität zur Folge; der Sättigungswert ist erreicht und kann nicht überschritten werden.

Michaelis-Menten-Kinetik

Eine typische Enzym-Kinetik
Autor: Ulrich Helmich 2016, Lizenz: siehe Seitenende.

Hier sehen wir noch einmal die gleiche Enzym-Kinetik wie in der Abbildung 1. Diese Abbildung soll zeigen, wie man die sogenannte Michaelis-Konstante Km graphisch ermittelt. KM ist ein quantitatives Maß für die Enzymaktivität.

Das Problem bei einer Sättigungskurve ist ja, man kann die Konzentration c(Glucose)max, bei der der Sättigungswert erreicht ist, nie genau ermitteln, auch wenn man die Kurve äußerst sorgfältig ermittelt und zeichnet. Ist der Sättigungswert in der Abbildung schon bei c(Glucose) = 1,40 mol/l erreicht oder erst bei 1,60 mol/l ?

Daher verfährt man bei der Bestimmung der Enzymaktivität etwas anders. Die maximale Geschwindigkeit vmax mit der das Enzym arbeitet, kann man recht leicht graphisch ermitteln, sie liegt bei 78 µl CO2/s (oberer rote Linie). Dazu reicht ein Lineal und ein Stift.

Nun halbiert man einfach diesen Wert und kommt auf 1/2 vmax = 39 µl CO2/s. An dieser Stelle zeichnet man eine zweite waagerechte Linie in das Diagramm ein. Diese Linie schneidet nun die Kurve, welche die Enzymkinetik darstellt. Mit einem Lineal kann man nun eine Senkrechte einzeichnen, welche die x-Achse schneidet. Und dann haben wir schon die Michaelis-Konstante KM mit 0,21 mol Glucose/l ermittelt.

KM ist die Michaelis-Konstante, also die Substratkonzentration, bei der das Enzym mit genau der halben maximalen Geschwindigkeit arbeitet, weil genau die Hälfte aller Enzym-Moleküle einen Enzym-Substrat-Komplex ES bildet.

"Die Michaelis-Konstante steht für die Affinität des Enzyms zu seinem Substrat, je kleiner sie ist, desto höher ist die Affinität" [1].

Wie ist diese Aussage zu verstehen?

Im Laufe der Evolution haben sich die meisten Enzyme der durchschnittlich zur Verfügung stehenden Substratkonzentration angepasst. Zumindest passen die meisten KM-Werte zu der durchschnittlichen Substratkonzentration, der die Enzyme normalerweise ausgesetzt sind. Das hat den Vorteil, dass das Enzym sein Substrat rasch umsetzen kann. Auch eine leichte Erhöhung der Substratkonzentration kann das Enzym "verkraften", weil ja noch Kapazitäten frei sind. Wenn die normale Substratkonzentration dem KM-Wert entspricht, ist ja nur die Hälfte aller Enzym-Moleküle mit Substraten besetzt, die andere Hälfte "hat nichts zu tun" und kann auf Erhöhungen der Substratkonzentration reagieren.

Daher unterscheiden sich die KM-Werte verschiedener Enzyme sehr stark. Chymotrypsin hat einen KM-Wert von 5000 µmol, Carboanhydrase einen KM-Wert von 8000 µmol. Die Penicillinase hat einen geringen KM-Wert von 50, und die Arginin-tRNA-Synthetase setzt das Substrat Arginin mit einem KM-Wert von 3 um [3].

Arginin-tRNA-Synthetase ist ein Enzym, das bei der Translation eine wichtige Rolle spielt. Es belädt unter Verbrauch von ATP die transfer-RNA für Arginin, also ArgtRNA, mit der Aminosäure Arginin. Das Enzym setzt also drei Substrate um: Arginin, ArgtRNA und ATP. Man sollte nun ja denken, dass die KM-Werte für diese drei Substrate gleich groß sind. Das ist aber nicht der Fall. Der KM-Wert für Arginin liegt bei 3, der für ArgtRNA bei 0,4 und der für ATP bei 400 µmol [3].

Dieses Beispiel zeigt eindrucksvoll, dass ein- und dasselbe Enzym unterschiedliche KM-Werte für verschiedene Substrate besitzen kann.

Aufgabe

In der Leber wird Glucose. Zwei Enzyme dienen in der Leber zum Abbau der Glucose, nämlich Hexokinase und Glucokinase. Nun hat die Glucokinase aber einen 50 mal höheren KM-Wert als die Hexokinase.

Begründen Sie, welches Enzym hauptsächlich die Glucose abbaut, wenn die Glucose-Konzentration in der Leber sehr niedrig / sehr hoch ist.

Lösungsvorschlag:

Der KM-Wert der Hexokinase wird bereits bei sehr geringen Glucose-Konzentrationen erreicht. Die Hexokinase arbeitet also schon mit "halber Kraft", während die Glucokinase noch lange nicht ausgelastet ist. Sie würde erst bei einer 50fach höheren Glucose-Konzentration mit "halber Kraft" arbeiten. Bei niedrigen Glucose-Konzentrationen wird die Glucose also hauptsächlich durch die Hexokinase abgebaut. Bei einer hohen Glucose-Konzentration ist die Hexokinase dagegen völlig ausgelastet, allerdings ist ihre maximale Geschwindigkeit vmax nicht allzu hoch. Die meiste Glucose wird jetzt von der Glucokinase abgebaut.

Isoenzyme

Bei ständig wechselnden Substratkonzentrationen werden auch sogenannte Isoenzyme eingesetzt. Das sind Enzyme, die zwar unterschiedlich gebaut sind, aber trotzdem das gleiche Substrat umsetzen und die gleiche Reaktion katalysieren. Die eine Variante hat dann einen niedrigen KM-Wert und eignet sich daher gut für geringe Substratkonzentrationen, während die Iso-Variante einen höheren KM-Wert hat und somit besser für hohe Konzentrationen des Substrats geeignet ist. Oft haben die Isoenzyme eine fast identische Struktur. Genetisch kann man das leicht mit der Gen-Duplikation erklären. Das Gen für das ursprüngliche Enzyme wurde durch eine Chromosomenmutation dupliziert. Das Duplikat hat sich dann im Laufe der Evolution leicht verändert, so dass das resultierende Enzym eine etwas andere Aminosäuresequenz hat, was eine andere Struktur des aktiven Zentrums zur Folge hat.

Isoenzyme findet man auch in unterschiedlichen Zelltypen. Die Lactatdehydrogenasen vom Skelettmuskel und vom Herzmuskel sind Isoenzyme. Allerdings unterscheiden sich die beiden Isoformen nicht im KM-Wert, sondern in der Art und Weise, wie sie reguliert werden können. Die Herzmuskel-Isoform wird durch andere Stoffe gehemmt als die Skelettmuskel-Isoform.

Vertiefung: Enzymkinetik

Kurven wie in den Abbildungen 1 oder 3 erhält man über Untersuchungen zur Anfangsgeschwindigkeit v0 von Enzymreaktionen.

Gibt man ein Enzym mit einem Substrat wie Glucose zusammen, so ist die Enzymkonzentration in der Regel um mehrere Größenordnungen kleiner als die Substratkonzentration.

In einer Initialphase ist zunächst noch kein einziges Enzym-Molekül von einem Substrat-Molekül besetzt. Die Substrate müssen ja erst auf die Enzyme treffen, um Enzym-Substrat-Komplexe ES zu bilden. Am Anfang der Reaktion gilt also c(ES) = 0.

Bei den meisten Enzymen dauert diese Initialphase (engl.: pre-steady state) aber nur wenige Millisekunden, kann also bei kinetischen Untersuchungen vernachlässigt werden [2].

Das Problem bei den Versuchen zur Kinetik von Enzymreaktionen ist, dass die Substratkonzentration im Laufe der Reaktion abnimmt, gleichzeitig nimmt die Produktkonzentration zu.

Aufgabe 1

Beschreiben Sie die Abnahme der Substratkonzentration und die Zunahme der Produktkonzentration bei einer enzymatischen Reaktion!

Lösungsvorschlag:

Solange die Substratkonzentration so groß ist, dass das Enzym mit maximaler Kapazität arbeitet, also ausgelastet ist, nimmt die Substratkonzentration linear ab und die Produktkonzentration steigt linear an. Das liegt daran, dass die Enzym-Moleküle pro Sekunde immer nur eine begrenzte konstante Anzahl von Substratmolekülen umsetzen können.

Angenommen, in der Lösung befinden sich 10.000 Enzym-Moleküle, und jedes Molekül kann pro Sekunde 5.000 Substrat-Moleküle umsetzen, dann werden pro Sekunde 10.000 * 5.000 = 50 Millionen Substrat-Moleküle verarbeitet.

Erst wenn wie Substratkonzentration hinreichend klein geworden ist, so dass nicht mehr jedes Enzym-Molekül ständig besetzt ist, erfolgt eine Abnahme der Substratkonzentration nach einem Geschwindigkeitsgesetz 1. oder 2. Ordnung, wie wir es von normalen chemischen Reaktionen kennen. Je geringer die Substratkonzentration dann ist, desto geringer wird auch die Reaktionsgeschwindigkeit. Hier ist dann keine lineare Abnahme bzw. Zunahme der Substrat- bzw. Produktkonzentration mehr zu sehen, sondern die Kurven flachen sich immer mehr ab.

Will man also Aussagen über die Geschwindigkeit eines bestimmten Enzyms bzw. einer bestimmten enzymatischen Reaktion treffen, so muss man die Methode der Anfangsgeschwindigkeit wählen. Zu Beginn der enzymatischen Umsetzung kann ja die Substratkonzentration c(S) als konstant angesehen werden [2]. Im Experiment fährt man nun mehrere parallele Ansätze mit unterschiedlichen Substratkonzentrationen und stellt dann die Anfangsgeschwindigkeit v0 in Abhängigkeit dieser Substratkonzentrationen dar. So erhält man Graphiken wie in Abbildung 1 und 3 zu sehen.

Quellen:

  1. Kompaktlexikon der Biologie, Spektrum-Verlag
  2. Nelson, Cox: LEHNINGER Principles of Biochemistry. Macmillan Learning, New York 2021.
  3. Berg, Tymoczko, Gatto jr., Stryer: Stryer Biochemie, 8. Auflage, Springer Berlin Heidelberg 2018.